多物种细菌网络抑制尿路结石疾病，确保健康的草酸盐稳态
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作者：医学镜界
多物种细菌网络抑制尿路结石疾病，确保健康的草酸盐稳态
Aaron W. Miller, David Choy, Kristina L. Penniston, Dirk Lange,
Inhibition of urinary stone disease by a multi-species bacterial network ensures healthy oxalate homeostasis,
Kidney International,
Volume 96, Issue 1,
2019,
Pages 180-188,
ISSN 0085-2538,
https://doi.org/10.1016/j.kint.2019.02.012.
(https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0085253819302315)
Abstract: The incidence of urinary stone disease is rapidly increasing, with oxalate being a primary constituent of approximately 80% of all kidney stones. Despite the high dietary exposure to oxalate by many individuals and its potential nephrotoxicity, mammals do not produce enzymes to metabolize this compound, instead relying in part on bacteria within the gut to reduce oxalate absorption and urinary excretion. While considerable research has focused on isolated species of oxalate-degrading bacteria, particularly those with an absolute requirement for oxalate, recent studies have pointed to broader roles for microbiota both in oxalate metabolism and inhibition of urinary stone disease. Here we examined gut microbiota from patients with and live-in individuals without urinary stone disease to determine if healthy individuals harbored a more extensive microbial network associated with oxalate metabolism. We found a gender-specific association between the gut microbiota composition and urinary stone disease. Bacteria enriched in healthy individuals largely overlapped with those that exhibited a significant, positive correlation with Oxalobacter formigenes, a species presumed to be at the center of an oxalate-metabolizing microbial network. Furthermore, differential abundance analyses identified multiple taxa known to also be stimulated by oxalate in rodent models. Interestingly, the presence of these taxa distinguished patients from healthy individuals better than either the relative abundance or colonization of O. formigenes. Thus, our work shows that bacteria stimulated by the presence of oxalate in rodents may, in addition to obligate oxalate users, play a role in the inhibition of urinary stone disease in man.
Keywords: intestinal microbiome; oxalate; Oxalobacter formigenes; urinary stone disease; urolithiasis
高草酸尿症被定义为尿液中草酸盐过量，通常为>45 mg/d，是草酸钙肾结石疾病的主要促成因素。草酸盐作为正常代谢的一部分在肝脏中内源性地产生，并且还从含草酸盐的食物中吸收，特别是当没有膳食成分（如钙）的拮抗时，这些成分在胃肠道中与草酸盐形成不溶性复合物。肠道细菌与草酸钙肾结石病之间的直接联系是在发现甲型草杆菌之后。这种共生肠道细菌物种使用草酸盐作为其主要营养来源，因为表达了一组特殊的酶，能够快速降解高浓度的化合物并防止其吸收到循环中。8， 9 还提出了一种机制，通过这种机制，O. formigenes能够刺激草酸盐从循环中分泌回肠道。10然而，许多研究已经调查了复发性肾结石形成剂和非结石形成对照的定植状态，并表明单独没有O. formigenes不是结石病的病因，因为一些复发性结石成形器被定植，而一些非结石成形剂则不是。事实上，研究报告，甲米根蚜血吸虫患尿路结石病 （USD） 患者的定植率在 8% 至 100% 之间，健康个体的定植率为 11% 至 100%，一些研究报告没有显著差异。 此外，O. 在报告这些结果的研究中，只有 55% 的研究中与尿草酸盐显著降低相关。最后，在最近一项涉及原发性高草酸尿症患者的临床试验中，尽管从粪便样本中大量恢复了甲壳虫的DNA ，但每天作为益生菌给予福米烯槐，持续8周，但未能减少尿中草酸盐的排泄。这些结果表明，除了O. formigenes之外，细菌种类对于传达对USD的保护可能很重要。
最近的研究已经超越了O. formigenes，并调查了有结石病史的患者与非结石形成对照组在肠道微生物群中的属水平差异。26，32，33，34 在这些研究中，拟杆菌属在USD患者中富集，而Prevotella在健康个体中富集。此外，在有24小时尿液结果的患者中，真杆菌属的存在与尿液草酸盐呈负相关。32在3项研究中，健康组和USD组之间的草杆菌没有显着差异。然而，在1项研究中，当使用草杆菌特异性引物时，100%的健康个体被O. formigenes定植，而USD患者只有17%。14在同一项研究中，与食用大量草酸盐的食草啮齿动物类似，发现患者含有其他草酸盐降解细菌的多样性，正如frc基因的存在所评估的那样。26，35 最后，最近进行的一项比较霰弹枪宏基因组分析的研究发现，与对照组相比，USD患者携带的草酸盐降解基因更少，种类更少，尽管草杆菌没有显着差异。34尽管这些研究确实显示了USD患者与健康对照组的肠道微生物群的明显差异，并且USD患者的草酸盐降解细菌的多样性和丰度较低，但他们没有确定可能负责草酸盐代谢和/或抑制USD的细菌合作网络。
为了更好地了解微生物网络对维持整体草酸盐稳态的重要性，Miller等人。研究了Neotoma albigula（白喉木鼠）的肠道微生物组，这是一种哺乳动物食草动物，其前肠含有一种微生物组，即使在浓度为12%时也非常有效地降解膳食草酸盐。 36木鼠微生物组的成分包括草杆菌，乳酸杆菌，梭状芽胞杆菌和肠球菌以及其他潜在的草酸盐降解细菌。35，36，37，38，39 这些研究确定了肠道微生物组对增加的膳食草酸盐的反应，刺激了以草杆菌科为中心的一致微生物核心群落，这对于草酸盐降解至关重要。为了确定类似的草酸盐降解微生物组是否在维持非结石形成人群的整体草酸盐稳态方面发挥作用，以及它们是否在结石疾病中起作用，我们检查了 USD患者与同居健康对照组肠道微生物群的差异，重点是与Oxalobacter相关的微生物网络，因为目前这是唯一与结石病有关的细菌物种。此外，与O. formigenes共生连接的物种（因此是Oxalobacter网络的一部分），但在草酸盐分解中没有直接作用，可以在非草酸盐结石类型的形成中发挥作用。这不仅提供了草酸降解微生物网络在草酸钙USD中的潜在作用的见解，而且还提供了在非草酸USD患者中相关生态失调的潜在作用。
结果
在目前的研究中，我们招募了17名USD患者以及17名没有USD的住家对照组。在样本采集前至少1个月内，没有受试者接触抗生素，也没有受试者报告接受过医疗程序和/或补充，导致肠道微生物组组成显著改变。在所有患者中，10例为通过结石分析或计算机断层扫描（Hounsfield单位测量）确认的草酸钙成石，2例患者有尿酸结石，2例患者有胱氨酸结石，1例患者有鸟粪石结石，2例患者有未知类型的结石。患者组由12男5女组成，平均年龄58.0±12.1岁，平均体重指数30.52±5.42 kg/m。2，除 1 例外，其他所有患者均有明显的结石复发史。对照组由5男12女组成，平均年龄为59.18±10.73岁，平均体重指数为25.85±5.87 kg/m。2 (表 1）。从所有患者和对照组收集习惯性饮食摄入量，以确定不同饮食对微生物组组成的潜在影响。从所有参与者那里收集粪便样本，用于16S核糖体RNA（rRNA）基因的高通量测序。
表 1.患者metadata
度量
控制
结石患者
男性性别
29
71
女性
71
29
年龄（年）
59.19 ± 10.73
58.0 ± 12.16
体重指数（公斤/米）2)
25.85 ± 5.87
30.52 ± 5.42
肥胖
18
42
诺诺贝斯
71
47
草酸钙
NA
53
胱氨酸
NA
12
尿酸
NA
12
鸟粪石
NA
6
美元历史（年）
NA
2–30
BMI，体重指数;不适用，不适用;美元，尿路石病。
数据是平均±SD或百分比。
USD患者和对照组在营养素摄入量和其他饮食参数（表2）方面没有差异，包括常量营养素组成和对饮食中潜在肾酸负荷和净内源性酸产量的估计。当按性别分层时，男性患者和对照组之间，女性患者和对照组之间在评估的任何饮食参数方面都没有差异。然而，患者组内男性和女性之间存在差异，特别是男性在饮食和净内源性酸产生方面的潜在肾酸负荷高于女性（-0.67 vs -12.68;P = 0.043（双尾 t-test），42.5 mEq/d 与 32.5 mEq/d;P = 0.013 分别来自双尾 t 检验）。
表 2.数据反映了病例和对照组食物频率问卷的饮食摄入量分析
空单元格 例 控制 P 值 能量（千卡/天） 2085 (1859) 1922 (1437) 0.65 PRAL一个 -5.2 (-6.0) -4.0 (0.0) 0.82 新能源b（毫当量/天） 39 (39) 40 (40) 0.79 蛋白质（克/天） 87 (81) 79 (65) 0.60 脂肪（克/天） 84 (79) 75 (55) 0.52 碳水化合物（克/天） 249 (226) 238 (182) 0.81 饱和脂肪（克/天） 26 (26) 23 (17) 0.58 穆法c（克/天） 33 (32) 29 (23) 0.47 普法d（克/天） 18 (18) 16 (13) 0.50 添加糖（茶匙/天） 13 (10) 13 (6.0) 0.82 纤维（克/天） 22 (21) 20 (20) 0.66 不溶性纤维（克/天） 15 (14) 14 (13) 0.46 可溶性纤维（克/天） 7.7 (7.3) 7.3 (7.2) 0.75 果糖（克/天） 23 (18) 22 (18) 0.85 全谷物（份数/天） 1.4 (1.2) 0.92 (0.65) 0.17 精制谷物（份数/天） 4.5 (4.1) 4.6 (2.8) 0.94 蔬菜（份数/天） 4.7 (4.5) 5.3 (4.9) 0.57 深绿色绿叶蔬菜（份/天） 0.80 (0.56) 0.98 (0.50) 0.59 深黄色蔬菜（份数/天） 0.43 (0.31) 0.51 (0.47) 0.56 干豆/豌豆（份/天） 0.12 (0.09) 0.12 (0.09) 0.93 白土豆（份数/天） 0.65 (0.44) 0.48 (0.30) 0.44 其他淀粉类蔬菜（份/天） 0.26 (0.23) 0.29 (0.22) 0.63 西红柿（份数/天） 0.59 (0.42) 0.59 (0.43) 0.99 其他蔬菜（份数/天） 1.8 (1.2) 2.3 (1.9) 0.45 水果（份/天） 3.1 (2.1) 2.8 (2.3) 0.71 柑橘，甜瓜和浆果（份量/天） 1.4 (0.77) 0.97 (0.80) 0.31 其他水果（份数/天） 1.8 (1.4) 1.8 (1.5) 0.87 乳制品（份数/天） 1.5 (1.3) 1.5 (1.2) 0.86 牛奶（份数/天） 0.80 (0.45) 0.56 (0.44) 0.35 酸奶（份数/天） 0.29 (0.31) 0.38 (0.26) 0.54 奶酪（份数/天） 0.44 (0.34) 0.52 (0.27) 0.65 肉类e（盎司/天） 4.5 (4.0) 4.0 (3.2) 0.58 鱼（盎司/天） 0.48 (0.46) 0.63 (0.50) 0.34 坚果和种子（盎司/天） 0.56 (0.41) 0.31 (0.30) 0.11 酒精（饮料/天） 0.37 (0.11) 0.26 (0.15) 0.50 维生素C（毫克/天） 135 (92) 119 (125) 0.56 维生素B6（毫克/天） 1.9 (1.8) 1.9 (1.7) 0.81 钙（毫克/天） 921 (769) 852 (846) 0.66 镁（毫克/天） 395 (415) 343 (323) 0.30 钠（毫克/天） 3298 (3309) 3090 (2567) 0.73 钾（毫克/天） 3691 (3607) 3358 (3200) 0.45
数据是每组的均值和中位数。P 值来自双侧 t 检验。
- a PRAL，食物的潜在肾酸负荷（涉及蛋白质，磷，钾，镁和钙摄入量的验证计算）。
- b NEAP，净内源性酸产生（涉及蛋白质和钾摄入量的验证计算）。
- c MUFA，单不饱和脂肪酸。
- d PUFA，多不饱和脂肪酸。
- e 包括来自所有哺乳动物、家禽、鱼类和海鲜的肉。
通过测序对USD和健康对照患者的肠道微生物群进行表征。对16S rRNA基因V4区域的测序 共产生了来自所有34个个体的2，207，898个高质量序列，总共7964个唯一操作分类单元（OTI）在97%相似度水平上定义。超过99%的OTU被分类到门的水平，61%被归类为属水平。患者和对照组都以厚壁菌门为主（两者均占总数的52%），其次是拟杆菌（两者均为22%）。分类学分析显示，与对照组相比，患者肠道微生物群中存在的Tenericutes门显着减少（图1a）。此外，尽管各组之间在α多样性方面没有显着差异（表3），但当考虑OTUs的相对丰度时，患者和对照组之间的肠道微生物群组成（β多样性）存在性别特异性差异（加权UniFrac分析）（图1b和c）。
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图 1.健康与尿路结石病（USD）队列之间整个肠道微生物群的表征。（a）微生物群的门水平图谱。统计分析（t检验）显示 USD 患者 Tenericutes 门显著减少 （P = 0.012）。（b） 微生物群落成员的β多样性，基于未加权的UniFrac分析。圆表示每个组比较中围绕质心的色散的多元均匀性。（c） 微生物群落结构的β多样性，基于加权UniFrac分析。圆表示每个组比较中围绕质心的色散的多元均匀性。双向排列多变量方差分析显示，对于加权 （c） 但不是未加权 （b） UniFrac 分析（加权 UniFrac − USD 状态：P = 0.071;性别：P = 0.221;性别*USD 状态：P = 0.018;未加权 UniFrac − USD 状态：P = 0.181;性别：P = 0.335;性别*USD 状态：P = 0.589）。NF，无女性;NM，无男性;PCoA，原理坐标分析;YF，是的，女性;是的，男。
表 3.阿尔法多样性的指标
变量
马加莱夫物种丰富度指数
均匀
指数
系统发育多样性
平均值（尿路结石病）
32.41
0.67
5.35
55.50
硒
5.61
0.03
0.26
8.77
平均（健康）
37.95
0.72
5.94
64.53
硒
5.73
0.02
0.17
8.11
P（t 检验）
0.49
0.15
0.07
0.46
使用 t 检验比较均值。
差异丰度分析显示，103个OTU在健康个体中显着富集，只有62个在患者中富集（图2a;补充表 S1）。尽管在健康个体中，O. formigenes的相对丰度和定植呈较高趋势，但组间差异不显着（图2b和c）。在整个数据集中，共有149个OTU与Oxalobacter sp.表现出显着的正相关关系（补充表S2）。就与Oxalobacter相关的细菌而言，健康组的共生相互作用数量比USD组高一个数量级（图2d）。
图 2.尿路结石病（USD）和健康队列之间功能相关细菌的差异丰度分析。（a） 各组之间差异很大的业务生物分类单位总数。红点表示显著富集的 OTI（103 个在健康队列中富集;62 个在 USD 队列中富集）。（b） 每组草杆菌定植（相对风险分析，P = 0.06）。（c） 每组草杆菌的相对丰度（t检验，P = 0.06）。（d） 每组中与草杆菌有显著正相关性的细菌共生相互作用的次数。
为了进一步确定健康个体是否比USD患者具有与草酸盐代谢相关的更强大的微生物网络，我们将本研究中健康组和USD组中富集的细菌列表与与草酸盐刺激的白瓜猪笼草中的Oxalobacter呈显着正相关的细菌列表进行了比较（图3）。36一些分类群，如Ruminococcus（来自Ruminococcaceae和Lachnospiraceae家族）和Oscillospira，其OTUs始终存在于健康个体中而不是患者中，与Oxalobacter的存在有关，并且在啮齿动物模型中受到草酸盐的刺激。然而，其他分类群，如拟杆菌，Akkermansia，Bifidobacterium，Coprococcus和Odoribacter，在所有4组中都有OTUs。
图 3.草酸盐微生物组的定量。将健康个体中富集或与草杆菌属呈正相关的属与新苜蓿中草酸盐刺激的属进行比较。蓝色表示在尿路结石病 （USD） 或健康组中显著富集的属，与 O. formigenes 相关，或受草酸盐刺激，紫色表示非显著关联。
讨论
在本研究中，我们试图解决有关肠道微生物组在复发性USD中的作用的重要知识差距，这些微生物组超越了甲壳虫和其他草酸盐降解细菌的作用。我们选择采取全球方法进行分析，而不是关注特定的患者亚群，例如高草酸尿症患者，因为我们希望确定患有USD的个体之间存在的潜在差异。在本研究中，我们将分析重点放在与草酸盐代谢相关的微生物网络上，因为迄今为止，这已被确定为与复发性肾结石疾病相关的唯一代谢途径。总体而言，我们假设健康个体将比USD患者拥有与草酸盐代谢相关的更强大的微生物网络。先前的研究表明，草酸盐代谢与多样化的细菌群落有关，而不是与单一物种有关，这表明代谢合作可能有助于在复杂和竞争环境中持续维持草酸盐降解细菌及其功能。36， 37 与O. formigenes相关的细菌的网络分析是仅使用微生物群快照来识别代谢合作细菌的一种方法，这对于临床研究很重要。
总体而言，我们发现与健康人群相比，所有USD患者的Tenericutes门显着减少（图1a）。此外，在群落结构方面存在性别特异性显着差异，但在患者和对照组之间的微生物群之间没有成员关系（图1b和c），这可能反映了基于性别的结石风险差异。40 在观察每组中特定 OTI 的差异丰度时，我们发现 62 个 OTI 在患者中富集，而在非结石形成对照中富集的 103 个 OTI。有趣的是，在对照中富集的OTUs列表中明显没有O. formigenes，这表明其他细菌物种对于预防USD和/或草酸盐稳态更为重要。此外，我们发现，与Oxalobacter相关的细菌的共生相互作用的数量比单独观察O. formigenes的存在与不存在更有效地区分了健康对照组的患者。
为了鉴定在草酸盐稳态中具有重要性的细菌分类群，我们将健康个体中富集并与Oxalobacter sp.相关的细菌列表（来自本研究）与饮食草酸盐刺激的细菌物种列表进行了比较。38这种草食性啮齿动物是研究微生物草酸盐代谢的理想选择，因为该物种已经在野外食用了数千年的高草酸盐饮食，因此由于实验室饲养，剧烈的饮食变化或抗生素暴露而没有失去任何细菌，就像实验室啮齿动物和人类一样。35我们的比较揭示了2个要点。首先，一些分类群，如Ruminococcus（来自Ruminococcaceae和Lachnospiraceae家族）和Oscillospira，其OTUs（i）始终存在于健康个体中而不是患者中，（ii）与Oxalobacter的存在有关，和（iii）在啮齿动物中受到草酸盐的刺激。这证实了先前研究USD和健康人群之间微生物群组成差异的研究，26，33发现涉及Ruminococcus和Oscillospira的OTUs在对照中富集。斯特恩等人32没有进行这些观察，但报告了属级的差异，而不是OTU级的差异。我们的比较揭示的第二点是，一些分类群，如拟杆菌，Akkermansia，双歧杆菌，Coprococcus和Odoribacter，在所有比较组中都有OTUs受到刺激，这一发现在很大程度上与Suryavanshi和Stern的研究一致。26， 32 因此，我们的数据提供了初步证据，表明以前与啮齿动物草酸盐代谢相关的分类群也传达了对人类USD的保护作用。此外，我们发现患者和对照肠道微生物群之间不同的OTU包括分类群，如脱硫弧菌和甲醇短杆菌，它们参与硫酸盐还原，产甲烷和乙酰发生。这些细菌物种可能与O. formigenes密切相关，因为产甲烷菌，乙酸根和硫酸盐还原细菌使用甲酸盐，甲酸盐是O. formigenes草酸盐代谢的主要副产品，这就是为什么我们认为它们共同关联。类似地，醋酸根使用CO2，另一个主要副产品来自草酸盐分解，产生乙酸盐，对宿主和其他微生物有益。甲米茄不表达同化甲酸盐或一氧化碳所需的酶2增加了它必须依靠其他细菌物种来实现这些功能的可能性。这强调了除直接参与草酸盐分解的细菌以外的细菌在体内草酸盐代谢中发挥重要作用的可能性，如前所述。37这一观察结果可能进一步解释了为什么单独使用O. formigenes的再定植只有短暂的结果。23未来的微生物研究旨在了解草酸盐微生物组成员在功能水平上的良好相互作用，将更好地了解每个成员的作用及其在维持整体非结石形成环境中的重要性。
一个有趣的发现是，草酸盐降解微生物网络的紊乱也存在于非草酸盐结石患者中。总的来说，本研究中至少有5名患者的结石不是草酸钙，但他们的微生物组显示出生态失调，其中包括草酸降解微生物网络的成员。虽然样本数量可能很低，但数据确实表明，肠道微生物组的紊乱，包括与此处确定的草酸盐降解微生物网络相关的成员，可能会增加发展其他结石类型的风险，并需要在更大的研究中进一步调查。
病例和对照组之间没有饮食差异表明，观察到的肠道微生物群差异与结石和/或其他因素的病理生理学有关，而与饮食无关。虽然对加拿大国立卫生研究院饮食史问卷（C-DHQ-I）结果的营养分析不包括草酸盐（由于营养分析软件的限制），但草酸盐摄入量的替代测量，包括全谷物，蔬菜（包括作为单独类别的深绿叶蔬菜），土豆，坚果和种子以及大豆，没有显示出任何差异。此外，影响胃肠道膳食草酸盐吸收的饮食因素（例如，钙和镁）在各组之间没有差异，进一步支持肠道微生物组组成差异在影响与结石形成相关的成分的吸收中的作用。
众所周知，肠道微生物组在维持整体健康方面起着重要作用，其生态失调与包括USD在内的许多疾病状态有关。特别是对于草酸钙USD，感兴趣的主要物种是O. formigenes，尽管其他兼性草酸盐降解物种也是研究的主题。8，13，23，31，44，45，46，47，48，49，50几个因素表明，尽管O. formigenes和其他草酸盐降解细菌确实与肠道中的草酸盐代谢有关，但它们不仅对功能负责，也不足以抑制草酸钙USD。首先，尽管大多数患者没有被这种严格的草酸盐降解细菌定植，但对于非结石形成的个体也是如此。此外，许多草酸钙 USD 患者通过 O. formigenes 定植。51其次，尽管含有O. formigenes或兼性草酸盐降解细菌混合物的益生菌确实可以减少尿液草酸盐的排泄，但它们的作用（如果有的话）通常是短暂的。13，23，31，44，47，48，49，50，52相反，给定来自Albigula猪笼草的全粪便移植，其胃肠道中含有高效的细菌草酸盐降解网络，Sprague-Dawley大鼠表现出尿液草酸盐的显着和持续性减少。37，38 第三，肠道微生物组是一个高度共生的环境，由复杂和集成的功能微生物网络组成。
总之，我们的研究结果表明，胃肠道中健康的草酸盐稳态可能不归因于单独的O. formigenes的作用，而是可能涉及许多细菌物种之间的协作努力，包括Ruminococcus和Oscillospira。这肯定与肠道微生物组的高度共生环境一致，其中一个例子是在我们的样本中将产甲烷菌物种与O. formigenes共定植。此外，我们的数据表明，草酸盐微生物组的缺失成员在增加形成非草酸盐结石的风险方面具有潜在作用，这与肠道微生物组的高度共生性质一致，需要进一步研究。尽管本研究的结果基于肠道微生物群的单一快照，但它们为草酸盐降解微生物网络和USD的作用的更广泛研究提供了强大的动力。
方法
该研究获得了不列颠哥伦比亚大学临床研究伦理委员会的批准，并获得了所有参与者的知情同意。所有纳入的受试者在提供样本前30天内没有抗生素暴露，并且根据入组时获得的详细病史，他们没有影响肠道微生物组组成的干预措施/治疗。然而，我们没有确定每位患者的每日排便次数，这可能会影响下游的微生物组组成。患者至少有 1 次结石复发，并且没有原发性高草酸尿症家族史，而对照组与患者生活在同一家庭中，并且没有 USD 的个人或家族史。受试者人口统计特征见表1。基于先前微生物群组成研究结果的功率分析表明，我们的样本量给出了检测群落组成差异和差异丰度差异的65%的功效。使用C-DHQ-I评估病例和对照组的饮食摄入量。该工具是一个公开的食品频率问卷，包括134种食品 - 基于2001年至2002年，2003年至2004年和2005年至2006年全国健康和营养检查调查的国家膳食数据 - 以及11个膳食补充剂问题。C-DHQ-I查询过去一年摄入量的受试者，评估习惯性摄入量，并包括有关份量的问题。在收集每个受试者的粪便样本之前，向他/她的粪便样本提供了纸笔版本的问卷。使用美国国家癌症研究所专门为该仪器开发的Diet*Calc软件分析了C-DHQ-I的数据。计算营养和食物组摄入量估计数。
研究参与者在样本交付的早晨将粪便样本收集到提供的容器中。到达我们的设施后（排便后4小时内），粪便样本在4°C下储存，然后等分到微量离心管中，随后在-80°C下储存，直到DNA提取。根据制造商的说明，使用QIAamp DNA粪便迷你试剂盒（51504，Qiagen，Hilden，德国）提取和纯化粪便DNA，并修改细胞裂解缓冲液（4%[w / v]十二烷基硫酸钠，500 mM NaCl，50mM乙二胺四乙酸，50mM三（羟甲基）-氨基甲烷，pH 8.0）和使用额外的玻璃裂解珠（0.3g 0.1 mm珠子和0.1g 0.5mm珠子）进行更彻底的裂解 的厚壁菌。Kozich等人根据方案从粪便DNA中制备了16S rRNA文库。55 根据制造商的说明，使用Phusion Hot Start II DNA聚合酶（2 U / μl）试剂盒（F549S，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）在50μl反应中扩增提取的DNA，并对聚合酶链反应（PCR）循环进行以下修改：在98°C下初始变性2分钟，98°C的30个循环进行20秒的延长， 55°C用于15秒的延伸，72°C用于30秒的延伸，然后在72°C下最终延伸10分钟，并在4°C下保持。为了验证PCR的成功，分析了PCR产物的随机子集，以查找凝胶电泳上的可见条带。PCR产物使用Agencourt AMPure XP磁珠（A63880，贝克曼库尔特，布雷亚，加利福尼亚州）进行清洁，磁珠与样品比为0.8：1。使用SequalPrep归一化板试剂盒（A1051001，Invitrogen，Carlsbad，CA）将清洁的PCR产物归一化至1至2ng / μl的浓度。将每个归一化样品的五微升合并到单个文库中，并使用DNA Clean & Concentrator-5 Kit（D4013，Zymo Research，Irvine，CA）进一步浓缩。使用高灵敏度 dsDNA 测定（5067-4626，安捷伦，圣克拉拉，加利福尼亚州）在安捷伦生物分析仪上分析合并的文库，以确定近似文库片段大小并验证文库完整性。QIAquick凝胶提取试剂盒（28704，Qiagen）用于在合并的文库中提取正确测序的16S rRNA扩增子，并排除非预期的扩增子。使用Illumina的KAPA文库定量试剂盒（KK4824，Kapa Biosystems，Wilmington，MA）确定最终合并文库的浓度。然后将文库稀释至4 nM并使用0.2 N NaOH变性为单链。最终的文库上样浓度为8 pM，另外还有20%的PhiX（FC-110-3001，Illumina，San Diego，CA）用于测序质量控制。然后将16S rRNA池化文库在Illumina MiSeq平台上进行测序。
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