长期暴露于DEHP可通过破坏宿主脂质代谢和肠道菌群诱导小鼠肥胖
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作者：微生态
编译：微科盟京墨，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。
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导读
背景：大量流行病学研究结果表明，邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）作为一种可干扰人体内分泌的工业用增塑剂，是导致肥胖高发病率的因素之一。然而，膳食途径的DEHP暴露诱导肥胖的潜在发病机制在很大程度上仍然是未知的。
方法：本实验通过饲料对小鼠进行不同剂量（0.05和5mg/kg体重）的长期DEHP暴露，持续14周后采集样本进行分析。通过将靶向定量代谢组学（LC/GC-MS）与基于整体核磁共振氢谱（1H NMR）的代谢谱相结合，探索不同剂量的膳食DEHP暴露对小鼠脂质代谢的影响。同时采用宏基因组学（16S rRNA基因测序）检测DEHP暴露后小鼠盲肠内容物中肠道菌群组成的改变。
结果：结果表明，通过饮食途径的两种剂量DEHP暴露可通过促进脂肪酸摄取和破坏磷脂、胆碱代谢，诱导小鼠体重增加及肝脏脂肪生成。膳食DEHP暴露改变了肠道菌群群落，破坏了肠道形态，降低了小鼠盲肠内容物中厚壁菌门（Firmicutes）与拟杆菌门（Bacteroidetes）的比例。此外，DEHP暴露可激活了肠道菌群的发酵过程，产生过量的短链脂肪酸。
结论：上述发现为长期、慢性DEHP暴露通过破坏小鼠脂质代谢和肠道菌群诱导肥胖这一结论提供了系统性依据，不仅验证了已有的流行病学结果，而且拓展了我们对环境污染物暴露导致的代谢性疾病的认识。
图文摘要
论文ID
原名：Long-term chronic exposure to di-（2-ethylhexyl）-phthalate induces obesity via disruption of host lipid metabolism and gut microbiota in mice
译名：长期暴露于邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯可通过破坏宿主脂质代谢和肠道菌群诱导小鼠肥胖
期刊：Chemosphere
IF：7.086
发表时间：2021年9月29日
通讯作者：张利民，陈晓宇
通讯作者单位：中国科学院精密测量科学与技术创新研究院，广西壮族自治区人民医院
DOI号：10.1016/j.chemosphere.2021.132414
实验设计
前言
邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）是一种常见的邻苯二甲酸酯，通常作为增塑剂用于聚合物产品，包括聚氯乙烯（PVC）、医疗设备、个人护理用品和食品包装。当塑料产品接受蚀刻、加热或机械研磨工艺处理时，DEHP会释放到环境中。因此，在饮用水（0.05-3.47 μg/L）、废水（0.72-400 μg/L）、土壤（1.0-264 mg/kg干重）和沉积物（8.0-479 g/kg）中常可检测到DEHP。人类每天接触到的DEHP约为25 μg，主要是通过食物、包装和水的口服摄入。最近的研究表明，在153名中国参与者中，超过95%的人的血浆中定量检测到了DEHP（11.13 ng/ml ± 3.95）。美国的一项全国性健康和营养调查表明，尿液中的DEHP水平与青少年出现胰岛素抵抗的概率相关，而胰岛素抵抗是肥胖和糖尿病的前兆。许多研究表明，DEHP具有生殖和发育毒性，可导致精子数量和质量下降，以及后代骨骼异常。长期DEHP暴露还被证明会导致脂质代谢异常和代谢性疾病，如非酒精性脂肪肝（NAFLD）、肥胖和癌症。因此，在2012年，美国卫生与公众服务部（DHHS）和美国环境保护署（USEPA）将DEHP列为内分泌干扰化合物（EDC）和人类致癌物之一（USEPA，2012）。
越来越多的证据表明，DEHP作为一种内分泌干扰物，通过与各种核受体，如组成型雄性激素受体2（CAR2）、过氧化物酶体增殖剂激活受体（PPAR）和芳烃受体（AHR）的相互作用而发挥毒性作用。既往的一项研究报告称，DEHP激活了小脑中的AHR/PXR/CAR通路，并破坏了小脑细胞色素P450酶系统的平衡，从而可能有造成人类神经系统疾病的风险。DEHP暴露可通过激活PPARγ和下游靶基因，如CCAAT/增强剂结合蛋白α（Cebpα）和甾醇调节元件结合因子1（Srebf1），诱导小鼠脂肪生成和随后的肥胖。以往体外研究表明，DEHP可以水解为邻苯二甲酸单-2-乙基己酯（mono-2-ethylhexyl phthalate，MEHP），随后通过选择性的PPARγ依赖机制诱导脂肪细胞分化。然而，另一项研究报告称，DEHP暴露可调节肝脏能量代谢和脂肪酸分解，以通过物种特异性的PPARα依赖机制抑制高脂肪饮食引起的肥胖。关于DEHP暴露的不利影响，目前的研究结果仍有争议，需要进一步的调查以阐明DEHP暴露诱发肥胖的分子机制。
众所周知，长期暴露于EDCs可能导致肥胖和相关代谢紊乱的风险增加，这与宿主脂质代谢和肠道微生物群失调高度相关。例如，长期低剂量的2,3,7,8-四氯二苯并呋喃（2,3, 7,8-tetrachlorodibenzofuran，TCDF）和三氯卡班（3,4,4'-Trichlorocarbanilide，TCC）暴露破坏了脂质代谢平衡，随后诱发了啮齿动物的肝脂肪变性。最近的研究表明，DEHP暴露通过激活大鼠肝脏和脂肪组织的JAK/STAT途径，导致脂质紊乱和肥胖。大约90%的DEHP摄入量来自人类的日常食物摄入，这使得胃肠道和相关的肠道微生物群有可能暴露于高水平的DEHP污染物。除了脂质代谢紊乱，饮食中DEHP暴露导致的肠道微生物群改变也可能导致肥胖和肥胖相关脂肪肝，这主要是由于肠道和肝脏之间的交互作用。以前的一项研究表明，DEHP的环境暴露改变了人类新生儿和小鼠的肠道微生物群落和代谢物特征。小鼠长期低剂量暴露于DEHP（0.2 mg/kg/天）可导致肠道微生物群失调，随后出现脂肪生成、能量消耗和葡萄糖代谢异常。尽管流行病学研究结果表明，环境中的DEHP暴露可能与人类肥胖症的发生率呈正相关，但饮食中DEHP诱发肥胖症的潜在机制在很大程度上仍然是未知的。
本研究旨在研究小鼠饮食暴露于DEHP是否会诱发宿主脂质代谢和肠道微生物群的改变，以及这些变化是否和/或如何导致肥胖的发生和发展。因此，研究者采用了靶向技术如脂质定量（UHPLC-QQQ-MS和GC-MS）、非靶向的基于1H NMR的代谢组学和16S rRNA基因测序相结合的方法来研究通过饮食暴露于不同剂量（0.05和5 mg/kg 体重）DEHP的小鼠的脂质谱和肠道菌群组成的改变。此外，通过扫描电子显微镜（SEM）可视化检查肠道菌群的形态和结构。此外研究者还监测了一些与肥胖有关的表型变化，包括体重、组织病理学变化、炎症状态、血清胰岛素和相关基因表达。这些观察为了解饮食中DEHP诱发肥胖症的分子机制提供了新的见解。
结果
1 长期膳食DEHP暴露诱导小鼠脂肪生成与肥胖
基于正常人群的每日摄入量和既往研究报告的的DEHP无可见有害作用水平（NOAEL），本文选择了两个DEHP的代表性剂量（0.05和5 mg/kg体重），大约相当于0.00405和0.405 mg/kg体重。两种剂量的饲料途径DEHP暴露持续14周均可诱导小鼠肝脏脂肪蓄积（图1A），并伴有体重显著升高（图1B）和肝脏与体质量比值上升（图1C）。在14周的平均每日摄入量无明显变化（图1D）的情况下，还观察到了肝脏甘油三酯水平显著升高（图1E）（对照组：0.04 mmol/g组织；DEHP处理组：0.08 mmol/g组织）和血清胰岛素水平的上升（图1F）。不同剂量的长期DEHP暴露还导致了小鼠的炎症状态，表现为肝脏中Tnf-α、Il-6和Il-1β等促炎细胞因子的mRNA显著增加（图1G）。总的来说，上述观察结果表明，两种选择剂量的DEHP长期饮食暴露可导致小鼠全身炎症反应、肝脏脂肪生成和肥胖。
图1. 小鼠DEHP暴露（0.05、5mg/kg体重）14周可引起肥胖。（A）暴露组和非暴露组的小鼠肝脏HE染色切片光学显微照片，箭头代表脂肪滴（条带=200μm）；（B）DEHP处理期间小鼠的体重；（C）小鼠的肝脏/体重比；（D）14周期间小鼠的平均每日摄入量。（E）小鼠肝脏甘油三酯（E）和血清胰岛素的定量水平（F）；（G）炎症因子的肝脏mRNA水平，包括Tnf-α、Il-6和Il-1β。数据表示为平均值±SD；每组n =7或8。通过双侧t检验或Welch t检验分析数据，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
2 PG和RG对体重和器官指数的影响
脂肪酸组成的靶向检测显示，DEHP暴露可剂量依赖性地诱导小鼠包括饱和脂肪酸（SFA：C18：0）和多不饱和脂肪酸（PUFA：C18：2n6c，C18：3n3，C18：3n6，C20：4n6，C20：5n3，C22：6n3）在内的肝脏脂肪酸丰度显著升高（图2A）。并且DEHP暴露下调了脂肪酸生物合成的成脂标志物，包括Acaca、Scd1、Fasn和Srebp1c（图2B）的水平，但未观察到对Ap2和Ppar-γ的mRNA水平存在显著影响。此外，DEHP处理显著增加了与肝脏从循环中摄取脂肪酸相关的编码蛋白Cd36的基因表达（图2C）。
图2. 膳食DEHP暴露对小鼠肝脏脂肪酸代谢的影响。（A）通过GC-MS进行总脂肪酸分析。（B）Acaca、Scd1、Fasn、Srebp1c、Ap2、Ppar-γ和Cd36的mRNA水平（c）。数据表示为平均值±SD；每组n = 7或8。双侧t检验分析，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
3. 膳食DEHP暴露影响磷脂和胆碱代谢
实验使用基于UHPLC-QQQ-MS的靶向代谢组学分析对参考内标物的磷脂进行定量，发现DEHP暴露后在小鼠肝脏中可检测到主要的58种磷脂，包括甘油磷酸胆碱（PC）、溶血磷脂酰胆碱（LPC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、甘油磷酸丝氨酸（PS）、甘油磷酸肌醇（PI）、甘油磷酸甘油（PG）和鞘磷脂（SM）。DEHP暴露诱导了肝脏在磷脂类别水平的代谢变化，表现为PC、PI、LPE、LPC和SM含量显著降低，PS和PG水平显著升高（图3）。DEHP干预小鼠肝脏中PC与PE的比值明显下调（图3E）。胆碱代谢物的靶向定量显示，包括氧化三甲胺（Trimethylamine N-oxide，TMAO）、肌氨酸、GPC和肌酐在内的胆碱代谢物丰度明显下降，胆碱、DMG和CDPC的水平升高（图4A）。此外，DEHP暴露后小鼠血清肌氨酸和TMAO的水平明显下降，而血清GPC的水平升高（图4B）。DEHP暴露显著下调了与CDP-胆碱和肌酐生物合成途径相关的酶的mRNA水平（如Chkb、Pcyt1a、Chdh、Mttp和Sardh）（图4C-D）。
图3. 饮食DEHP暴露对小鼠肝脏磷脂代谢物的影响。包括总磷脂（A）和每种特定代谢物的定量测量：PC（B）、LPC（C）、PE（D）、PC与PE比值（E）、LPE（F）、PS（G）、PG（H）、SM（I）和PI（J）。数据表示为平均值±SD；每组n = 7或8。采用双侧t检验或Welch t检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
图4. 饮食中DEHP暴露对胆碱代谢物的影响。胆碱代谢物的UHPLC-QQQ-MS定量测定:小鼠肝脏（A）、血清（B）。（C）小鼠肝脏中Chkb、Pcyt1a、Chdh、Bhmt、Dmgdh、Sardh和Mttp的mRNA水平。（D）胆碱代谢途径。数据表示为平均值±SD；每组n = 7或8。采用双侧t检验或Welch t检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
4. 膳食DEHP暴露影响肠道菌群形态和组成
扫描电子显微镜（SEM）图像显示，DHEP暴露显著破坏了肠表面形态，显著降低小鼠回肠中分节丝状菌（segmented filamentous bacteria，SFB）的丰度（图5A）。16S rRNA测序的加权UniFrac主坐标分析（PCoA）显示，DEHP暴露导致肠道菌群发生显著改变（图5B）。在门水平上，与对照组相比，DEHP处理组小鼠厚壁菌门（Firmicutes）水平较低，拟杆菌门（Bacteroidetes）水平较高，厚壁菌门/拟杆菌门比值降低（图5C-E）。DEHP暴露也剂量依赖性地增加了小鼠盲肠内容物中放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）的水平（图5F-G）。在属水平上，DEHP暴露导致小鼠盲肠内容物中乳杆菌属（Lactobacillus）相对丰度剂量依赖性下降（图5H），链球菌属（Streptococcus）和丁酸弧菌属（Butyrivibrio）水平升高（图5I和J）。
图5. 饮食中DEHP暴露对小鼠肠道菌群的影响。（A）回肠的SEM图像（条带=100μm）；（B） 基于Bray-crutis PCoA分析显示的小鼠盲肠内容物中肠道菌群组成。16S rRNA基因测序分析门（C-G）和属水平（H-J）小鼠盲肠内容物中肠道菌群。数据表示为平均值±SD；每组n = 5或6。采用双侧t检验或Welch t检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
5. 膳食DEHP对小鼠肝脏和粪便代谢组的影响
采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）的颜色分类系数图确定导致DEHP处理组和对照组之间统计学差异的的代谢物（图6、7）。在肝脏中，膳食DEHP暴露剂量依赖性地诱导脂质和胆碱代谢物的显著蓄积以及葡萄糖和糖原水平下调。相对高剂量的DEHP暴露显著上调了支链氨基酸（BCAA）和3-羟基丁酸（3-HB）的水平（图6B）。在粪便中，DEHP暴露显著上调了丁酸盐和丙酸盐等短链脂肪酸（SCFAs）的相对丰度，但显著降低了寡糖和葡萄糖的相对丰度（图7C-D）。此外，在DEHP处理的小鼠结肠中观察到G蛋白偶联受体（Gpr41和Gpr43）的mRNA水平剂量依赖性升高（图7E）。
图6. 膳食DEHP对小鼠肝脏代谢组的影响。肝脏1H NMR光谱模型，（A） 相对低剂量；（B）相对高剂量。（左）OPLS-DA得分图；（右）系数编码负载图。
图7. 饲料中DEHP对小鼠粪便代谢组和细菌发酵过程的影响。肝脏1H NMR光谱模型，（A） 相对低剂量；（B）相对高剂量。（左）OPLS-DA得分图；（右）系数编码负载图。相对丰度：SCFA和寡糖（C）；葡萄糖（D）。（E）小鼠结肠中Gpr41和Gpr43的mRNA水平（基于qPCR分析）。数据表示为平均值±SD；每组n =6或7。采用双侧t检验或Welch t检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
讨论
作为一种典型的内分泌干扰物，DEHP的不良反应诸如生殖障碍和内分泌干扰已得到了广泛研究。越来越多的流行病学结果表明，作为导致肥胖的一种环境因素，DEHP与肥胖发生率呈正相关。既往研究表明，对于C3H/He小鼠，DEHP可通过甲状腺功能减退和下丘脑瘦素抵抗的协同效应诱导肥胖。然而，DHEP对肥胖发生和发展的系统影响在很大程度上仍不清楚。本实验中，研究者观察到膳食DEHP暴露14周可诱导小鼠超重、肝脏甘油三酯（TG）和血清胰岛素水平升高、炎症状态加重、脂质代谢异常等病理生理学特征，并且可导致肠道菌群的形态和组成受损，这些都是明显的肥胖成因。胆碱能系统作为信息传递的基础，广泛参与突触连接；因此，胆碱能系统功能障碍与记忆障碍、认知缺陷密切相关。本实验发现PG和RG可抑制AChE活性，因此，PG和RG改善衰老小鼠模型的记忆障碍可能与其对胆碱能系统功能障碍的预防作用有关。后续的行为学检测结果与这一论证相符。RAM可用来评估年龄相关的认知和记忆能力，在试验中，用PG和RG补充D-Gal可减少总距离和跨越平台的总次数，以及检测错误的次数，相较而言RG治疗对逆转记忆和认知下降的作用更大。RG和PG治疗后大脑异常组织形态的改善证明了RG和PG对D-Gal诱导的脑组织变性的治疗作用。 众所周知，脂质代谢异常和炎症状态可导致多种代谢综合征，如脂肪肝、肥胖和癌症。在本研究中，DEHP暴露小鼠肝脏中数种脂肪酸和TG的丰度显著升高，并伴有病理学检查发现的组织脂滴蓄积，表明肝脏脂肪大量生成和脂肪肝的疾病可能。此外，膳食DEHP暴露剂量依赖性引起血清胰岛素水平显著升高，导致身体所储存的脂肪与体重增加，肥胖产生。先前研究结果表明，DEHP及其代谢物邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（MEHP）暴露加速了小鼠3T3-L1细胞系中的脂肪细胞分化，并诱导了小鼠肥胖，这与本研究的结果相符。这一结果与最近发表的啮齿类动物处于2，3，7，8-四氯二苯并呋喃（TCDF）和微囊藻毒素-亮氨酸-精氨酸（MC-LR）环境暴露所致的肝脏脂肪生成结果相似。有趣的是，饲料途径的DEHP暴露可剂量依赖性地诱导小鼠体内参与肝脏脂肪酸生物合成的脂肪生成基因（Acaca和Scd1）mRNA水平显著降低，表明DEHP暴露14周可抑制脂肪酸的生物合成。这一结果似乎与DEHP暴露导致的小鼠肝脏脂肪蓄积不一致，事实上，DEHP暴露显著上调了小鼠肝脏Cd36的水平，而这与脂肪转运或摄取密切相关，表明膳食DEHP摄入可促进脂肪酸摄取或通过机体的循环转运。这些与脂肪酸代谢相关基因表达相关的结果与大鼠饮用水MC-LR暴露诱导的结果一致，而与先前报告的TCDF暴露结果相反。因此，DEHP和MC-LR诱导的这种肝脏脂肪生成可能部分归因于脂肪酸的活化摄取和循环。 小鼠磷脂和胆碱代谢物（细胞膜结构的关键成分）的破坏从另一方面证实了DEHP暴露诱导的脂质代谢异常。在本研究中，饮食DEHP处理小鼠肝脏中PC、PI、LPE、LPC和SM的丰度显著降低、PS和PG上调均表明，DEHP暴露导致细胞膜完整性破坏。值得注意的是，DEHP暴露显著下调了小鼠肝脏中PC与PE的比率，这与之前的研究一致，即在暴露于二-（2-乙基己基）己二酸酯（DOA）和DEHP导致肝肿大的大鼠中，PC与PE的比率降低。然而，已有研究表明TCDF暴露显著升高了小鼠的肝脏PC/PE比值，且与内质网应激相关。在高脂饮食诱导的小鼠肥胖中可观察到LPC尤其是LPC 16:0的显著耗竭。此外，DEHP暴露可抑制胆碱代谢物表达，表现为小鼠肝脏中肌氨酸、肌酐、TMAO和GPC水平显著下调，胆碱、DMG和CDPC水平上调。众所周知，胆碱是通过CDP-胆碱途径合成PC的前体。在DEHP处理的小鼠肝脏中观察到参与CDP-胆碱途径的mRNA（Chkb、Pcyt1a、Chdh、Mttp和Sardh）显著减少，表明DEHP引起的脂肪生成可能部分归因于对PC生物合成的抑制。此外，DEHP暴露诱导的脂肪生成和肥胖也可与炎症状态明显相关，如小鼠肝脏中炎性细胞因子Tnf-α、Il-1β和Il-6剂量依赖性的上调。 越来越多的证据表明，肠道菌群微生态失调与多种常见疾病高度相关，如脂肪肝、肥胖和2型糖尿病。本研究中，膳食DEHP暴露导致肠道菌群形态和组成显著破坏，表现为厚壁菌门显著下调和拟杆菌门（肠道菌群的主要组成）上调。厚壁菌门/拟杆菌门比率显著降低进一步证实了膳食DEHP暴露可诱导肥胖，因为厚壁菌门/拟杆菌门比率是众所周知的肥胖指标。在四氯二苯并呋喃（TCDF）诱导的肝毒性病例中也观察到诸如非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和肝脂肪变性的相似结果。DEHP干预14周的小鼠粪便中，SCFA显著升高、葡萄糖和寡糖水平显著降低也可作为DEHP暴露导致脂肪生成和肥胖的进一步支持性证据。此外，DEHP处理增加了丁酸弧菌属丰度，而后者能够发酵糖和纤维糊精产生丁酸盐。DEHP显著升高结肠中的Gpr41和Gpr43的mRNA水平，进一步表明肠道中SCFA的吸收和利用增高。这些观察结果显示，DEHP暴露显著促进了细菌发酵过程，产生过量的SCFA，并为身体提供了额外的能量，最终导致小鼠肝脏脂肪生成和肥胖。
结论
两种替代剂量的长期膳食DEHP暴露均可显著诱导小鼠肝脏脂肪生成和肥胖，表现为脂肪酸、磷脂和胆碱代谢破坏。此外，DEHP暴露引起肠道菌群微生态失调，包括肠道菌群形态和组成的改变及细菌发酵过程的激活，二者与肥胖的发生、发展均高度相关。这一研究发现为环境DEHP可作为肥胖和肥胖相关疾病的潜在病因提供了新的证据。
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